在開始RT-PCR定量檢測之前，請閱讀關于PCR的實驗方案和操作建議。RNA的純度和完整性是合成全長cDNA的關鍵。RNA的質量受RNase A的影響，RNase A是一般實驗室環境中存在的非常穩定的污染物。因此，從事RNA研究時，需要時刻考慮到RNase污染的問題。所有Thermo Scientific應用于逆轉錄反應的產品(包括酶、緩沖液、水、核苷酸和寡核苷酸)經嚴格測試均不含RNase污染。 為防止污染這些高質量的組分，實驗室環境和所有自制溶液也必須無RNase污染。
避免RNase污染的常規操作建議：
• 用DEPC處理所有在cDNA合成中將要使用的試管和槍頭，或使用經過認證的無RNase的實驗室器具。
• 使用RNA工作的移液器。
• 操作RNA和所有試劑時需佩戴手套，因為皮膚是RNase的主要來源。經常更換手套。
• 使用鑒定合格的試劑，包括高質量的水(如DEPC-treated water)。
• 使用RNase抑制劑來穩定RNA，例如RiboLock RNase Inhibitor (#EO0381)。
• 進行cDNA合成前，要求對RNA的完整性進行鑒定。
• 例如，如果在總RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳中，人的18S rRNA(分子量約1.9kb)和28S rRNA(分子量約為5kb)都形成了非常窄的條帶，則認為該樣品中的mRNA是完整無缺的。
RT反應混合物的組分
模板RNA
標準方法分離的細胞總RNA，可與Thermo Scientific逆轉錄酶或*鏈cDNA合成試劑盒一起成功使用。純化的RNA要求無鹽、金屬離子、乙醇和酚殘留，以避免在逆轉錄反應期間
產生抑制作用。另外，RT-PCR的模板RNA必需無DNA污染，以避免PCR或qPCR出現假陽性結果。推薦使用DNase I，RNasefree(#EN0521)除去制備的RNA中痕量的DNA殘留。設置RT-PCR對照反應，對照組中模板是未經逆轉錄的RNA。
從制備的RNA中除去基因組DNA：
1. 在RNase-free的試管中加入以下組分：
| RNA | 1-2 μg |
| 10x reaction buffer with MgCl2 | 1 μl |
| DNase I, RNase-free (#EN0521) | 1-2 μl (1-2 U) |
| DEPC-treated Water | to 9 μl |
| Total volume | 10 μl |
2. 37℃孵育30分鐘。
3. 加入1μl 50mM EDTA后，65℃孵育10分鐘。無螯合劑存在時加熱將促使RNA水解2。或者使用酚/氯仿抽提RNA。
4. 所制備的RNA可用作逆轉錄的模板。
備注：
• 每μg RNA，不要使用超過1U的DNase。
• 如果有大量RNA，可以將反應體系放大。
• 推薦的RNAzui終濃度為0.1-0.2 μg/μl。
• RiboLock RNase Inhibitor(#EO0381)也可以加入到反應體系中，抑制可能存在于起始RNA溶液中的RNase A。推薦使用濃度為1U/μl。
引物
oligo(dT)18、隨機引物或基因特異性引物均可用于*鏈cDNA的合成。Oligo(dT)18引物從真核mRNA 3’-末端的Poly(A)尾開始合成cDNA。而隨機引物，如六聚體引物，可以從所有類型RNA（rRNA和mRNA）開始進行cDNA合成。因此，使用隨機引物合成的cDNA比使用Oligo(dT)18引物合成的cDNA更加復雜，可能降低接下來PCR反應的靈敏度和/或特異性。然而，隨機引物可以優先應用于以下幾種情況：使用無poly(A)尾的真核生物mRNA進行cDNA合成，或使用富含poly(A)的RNA模板進行cDNA合成，以及進行長片段mRNAs 5’-區域的RT-PCR?；蛱禺愋砸餅閏DNA合成提供了zui高的特異性，引物由用戶自己制備。
逆轉錄酶
所有的Thermo Scientific 逆轉錄酶均適用于全長*鏈cDNA合成，但逆轉錄酶在反應溫度、可轉錄的RNA量、靈敏度和RNase H活性方面有所不同。每種酶推薦使用的反應條件請
參見《使用RNA作為起始材料：用于RT-PCR和RT-qPCR的Thermo Scientific解決方案 》
*鏈cDNA的合成
下面列出了使用RevertAid H Minus Reverse Transcriptase進行*鏈cDNA合成的實驗方案。使用其它種類逆轉錄酶的相應反應條件，請參見第56頁的逆轉錄酶選擇表。Master Mix
為了準備多個平行實驗并zui大程度減少加樣誤差和污染，先將除了RNA和引物之外的所有反應組分預先混合制備RT master mix。制備足量的master mix(足夠用于所需反應并多配制一份以補償加樣誤差)。將模板RNA加入到各個試管中，并置于冰上。將所制備的master mix等分加入含有RNA的試管中。各組分自冷藏取出后，融化混勻并短暫離心，冰浴放置。
1. 按以下順序在無菌、nuclease-free的試管(冰浴放置)中加入以下組分：
| 模板 RNA | 總 RNA 或 poly(A) RNA 或特異性 RNA | 0.1 ng - 5 μg 10-500 ng 0.01 pg - 0.5 μg |
| 引物 | Oligo(dT)18 引物 (#SO131) 或隨機六聚體引物 (#SO142) 或基因特異性引物 | 0.5 μg (100 pmol) 0.2 μg (100 pmol) 15-20 pmol |
| DEPC-treated Water (#R0601) | to 12.5 μl | |
| 總體積 | 12.5 μl | |
2. 任選：如果RNA模板GC含量高，或含有二級結構，則需要輕輕混勻，短暫離心，65℃孵育5分鐘后在冰上急冷，短暫離心后冰浴放置。
3. 按順序添加下述組分，或制備master mix：
| 5x 反應緩沖液 | 4 μl |
| RiboLock RNase Inhibitor (#EO0381) | 0.5 μl (20 U) |
| dNTP Mix, 10 mM each (#R0191) | 2 μl (1 mM終濃度) |
| RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (#EP0451) | 1 μl (200 U) |
| 總體積 | 20 μl |
4. 輕輕混勻并短暫離心。
5. 如果引物為 oligo(dT)18 或基因特異性引物，反應條件為42℃孵育60分鐘。如果使用隨機六聚體引物，則在25℃孵育10分鐘后，再在42℃孵育60分鐘。對于GC含量高的RNA的轉
錄實驗，可將反應溫度升高到45℃。
6. 反應液70℃加熱5分鐘以終止反應。
備注
• 逆轉錄產品可直接用于PCR中，或在-20℃下儲存。
• 在50μl PCR反應體系中，使用2μl 逆轉錄反應混合物。
qPCR優化指南
| 優化參數 | 建議 |
| qPCR 板 | 建議使用不透明的白色PCR板進行qPCR檢測。這種白顏色實質上消除了孔與孔之間的串聯干擾，并提高了熒光探測的效率，從而增加了定量檢測的靈敏度以及孔與孔之間的一致性。 |
| 模板質量 | qPCR檢測中使用的核酸要求具有足夠的純度。模板污染(如基因組DNA、蛋白質、碳水化合物或有機溶劑)會對定量檢測的可靠性和可重復性產生巨大影響。模板質量必須通過分光光度儀(如Thermo Scientific Nanodrop)、微流體或PAGE進行檢測。 |
| 擴增子長度 | 擴增子長度理想情況下，擴增子長度應在100bp至150bp之間，以確保qPCR反應效率盡可能接近100%。好的qPCR效率可以促進定量檢測的可重復性和靈敏度。對于特定試劑，遵守其使用說明中關于擴增子長度的要求。 |
| SYBR Green法 的引物設計 | 鑒于PCR引物是qPCR定量檢測中成本相對較低的一種組分，對于每一種新的qPCR定量檢測試劑，推薦訂購和測試至少兩對引物，增加建立可靠的、可重復的、靈敏的定量檢測方法的機會。 |
| 測試引物 | 使用SYBR Green法對一系列梯度稀釋的模板進行檢測，以確認qPCR定量檢測方法的重復性、特異性、靈敏度和動態范圍。理想情況下，qPCR反應的效率應高于90%，低于105%，而定量檢測的可重復性應高于r=0.998。 |
| 有效的RT | 實驗初始階段應根據供應商說明書中的方法進行逆轉錄實驗，但RT步驟的用時和溫度可以進行相應優化以提高逆轉錄酶的效率。應在一系列RNA濃度范圍上對逆轉錄酶進行測試，以確保定量檢測的線性度。 |
| 熱啟動 | qPCR方案包括在95℃加熱的步驟，以確保熱啟動DNA聚合酶被*激活。必須遵守試劑的使用說明。加熱步驟時間太短會影響定量檢測的重復性和靈敏度。 |
| 循環方案 | 循環方案即便您曾經使用其他供應商的混合試劑對您的定量檢測方法進行過優化，我們仍然建議使用Thermo Scientific qPCR master mix使用指南中推薦的熱循環方案。如果需要進行定量檢測方法優化，應該首先檢查退火溫度。 |
| 退火溫度 | 測試一系列的退火溫度。根據qPCR結果，應以2-3℃為單位升高或降低退火溫度。此操作可通過設定thermal gradient在一個簡單的實驗中完成。也可以使用多個qPCR實驗來測試一系列的退火溫度。 |
| 引物濃度 | 一般使用在master mix中推薦的引物濃度來進行qPCR反應。如果需要優化，嘗試以25mM為單位升高或降低引物濃度。 |
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